六味地黄丸对自杀基因系统杀伤肝癌细胞增效作用的量效关系

作者：杜标炎，张爱娟，谭宇蕙，易华，吴映雅，郭玉荣 【摘要】 【目的】观测六味地黄丸含药血清对自杀基因HSVtk/GCV系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的增效作用，探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性。【方法】构建HSVtk/GCV自杀基因治疗系统，并确定丙氧鸟苷（GCV）的工作浓度（392μmol/L）;制备SD大鼠4d和8d六味地黄丸（剂量为32g·kg-1·d-1）灌胃含药血清和生理盐水灌胃空白血清；用大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-或tk 与tk-1∶9比例混合细胞按3×103个/孔铺96孔板，分为空白血清组、GCV加空白血清组、10%tk /GCV加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组及10%tk /GCV联合含药血清组；含药血清又再分为低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组6个复孔，用完全培养基培养24h后，各组分别加入相应空白血清或含药血清，孵育12h，加入终浓度392μmol/L的GCV，培养60h，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞活性，Q值法分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性。【结果】空白血清组、含药血清组、GCV加空白血清组、GCV加含药血清组细胞均未显示明显的细胞毒性。10%tk /GCV加空白血清组及10%tk /GCV联合不同浓度的含药血清组均具有显著杀伤作用（与空白血清组比较，Ｐ＜００５），联合组存活率显著低于10%tk /GCV加空白血清组（Ｐ＜００５）；含药血清中剂量和高剂量组的联合作用具有协同性（Q＞11５），且有浓度依赖性。给药4d血清和给药8d血清结果无显著性差异（P＞005）。【结论】六味地黄丸含药血清对自杀基因系统10%tk /GCV杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞具有协同增效作用，且有一定的量效关系。 【关键词】 六味地黄丸/药理学；肝肿瘤/中西医结合疗法；基因治疗；肿瘤细胞，培养 自杀基因疗法由于存在旁杀伤效应的独特机制已成为恶性肿瘤基因治疗的研究热点和最有应用前景的肿瘤基因治疗方法，目前已在临床病人及实验动物中广泛用于恶性肿瘤试验性治疗，并已观察到较好的效果［1-4］。但体内自杀基因治疗仍存在载体转染效率低、靶向性不够、治疗载体的毒副作用等问题，严重制约了其临床应用。进一步提高疗效和减少毒副作用是研究热点之一，联合治疗则能在一定程度上达到上述目的［5］。中医药是一个伟大宝库，许多中药方药具有肯定的药理效应［6-8］，联合中医药也可能是一种可行的方案。我们已有的初步研究结果表明［9-10］，自杀基因治疗联合补肾方药六味地黄丸在体内和体外均能起到协同增效的作用。本研究拟在细胞水平上对其量效关系作进一步地论证，现将结果报道如下。 1材料和方法 11主要试剂与仪器RPMI1640为Gibco公司产品；新生牛血清为TBD公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）、丙氧鸟苷（Ganciclovir,GCV）、二甲基亚砜（DMSO）均为美国Sigma公司产品；细胞培养瓶、培养板、冻存管、滤膜等均为美国Corning公司或丹麦MUNC公司产品；BNA3210型CO2培养箱（日本ESPEC）；5WCJ1F超净工作台（苏州净化设备厂）；3K18型高速冷冻离心机（德国Sigma）;3169型倒置显微镜（重庆COIC）；ALG1104型电子天平（日本岛津）；CDBER SCAN 510型pH仪（意大利HANNA）；NEX POWER 1000型纯水器（韩国Human Corp）等。 12细胞株病毒包装细胞PT67购自美国Clontech公司，已于前期将重组pLXSNtk质粒转染入PT67细胞内构建了重组病毒包装细胞，记为PT67tk［11］。大鼠肝癌CBRH7919细胞购自中山大学动物中心细胞库。前期已用PT67/tk的含病毒上清培养液感染大鼠肝癌CBRH7919细胞，筛选获得稳定整合、表达tk基因的重组大鼠肝癌CBRH7919/tk 细胞［12］。 13实验动物SD大鼠，体质量180~230g，雄性，健康，清洁级［动物合格证号SCXK（粤）2003~0001，粤监证字2006A014；环境合格证号NO 0010470］，由广州中医药大学实验动物中心提供。 14GCV杀伤敏感性及GCV工作浓度的确定［10］大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk 铺96孔培养板；在铺板24h后加入梯度浓度GCV，MTT法测定细胞对GCV的敏感性，确定GCV的工作浓度为392μmol/L。 15六味地黄丸含药血清和空白血清的制备及血清对细胞生长的影响［10］16只SD大鼠随机分为2组，空白血清组灌胃生理盐水，六味地黄丸含药血清组灌胃六味地黄丸（32g·kg-1·d-1），制备4d和8d血清，-70℃冰箱保存备用。观测空白血清和含药血清对细胞生长的影响，结果表明血清能在一定程度上促进细胞增殖，但当血清浓度高于体积分数20%时细胞形态出现变化，故实验时采用对细胞生长影响较小的体积分数10%以下的血清浓度。 16自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清对肝癌细胞的杀伤效应将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk 和CBRH7919/tk-按1∶9的细胞数混合，作为自杀基因tk/GCV系统作用的细胞；没有自杀基因系统的实验组，其作用细胞均为tk-细胞，按3×103个/孔铺96孔板，分为空白血清组、GCV加空白血清组、10%tk /GCV加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组及10%tk /GCV联合含药血清组；灌胃8d含药血清又再分为低剂量组（25%含药血清 75%空白血清）、中剂量组（5%含药血清 5%空白血清）和高剂量组（10%含药血清），共设12组，每组6个复孔；灌胃4d含药血清则分为低剂量组（5%含药血清 5%空白血清）和高剂量组（10%含药血清），共设9组，每组6个复孔；血清浓度均为体积分数。用完全培养基培养24h后，加入相应空白血清和含药血清，孵育12h，再加入终浓度392μmol/L的GCV，培养60h后，以MTT法检测细胞活性。 17统计学分析和协同性分析采用SPSS 115统计软件，多组间两两比较用OneWay ANOVA,LSD法。协同性分析用金正均Q值法判断［13］，Q=实验联合药效R’（A B）/理论联合药效R（A B），理论联合药效R（A B）=RA RB-RA×RB，RA、RB为单独用药药效。Q＜085则判断为拮抗作用；085≤Q＜115则判断为相加作用；Q≥115则判断为协同作用。 2结果 21自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清（4d）对肝癌细胞的杀伤效应空白血清组、含药血清组、GCV加空白血清组、GCV加含药血清组细胞均未显示明显的细胞毒性，表明在实验条件下血清和GCV对肿瘤细胞的生长无明显影响。自杀基因系统10%tk /GCV加空白血清组及10%tk /GCV联合不同浓度的含药血清组均具有显著杀伤作用（与空白血清组比较，Ｐ＜００５），表明自杀基因系统具有生物学功能；10%tk /GCV系统联合5%、10%含药血清组的细胞存活率均显著低于10%tk /GCV加空白血清组（Ｐ＜００５或Ｐ＜００1）及相对应的含药血清组，联合组的实际抑制率均显著高于理论抑制率，Q值分别为116、149，均大于115，说明其相互作用具有协同性，且随着含药血清浓度的增高Q值增大，协同作用增强。结果见表1。 22自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清（8d）对肝癌细胞的杀伤效应10%tk /GCV自杀基因治疗系统联合25%、5%、10%浓度的含药血清，细胞存活率均显著低于含药血清组与10%tk /GCV加空白血清组（Ｐ＜００５或Ｐ＜００1）。联合组的实际抑制率均显著高于理论抑制率，Q值分别为086、120、142。但25%的含药血清联合组的Q值在085~115之间，为相加作用；而5%、10%浓度联合组均Q＞115，说明其增效作用具有协同性，且随着含药血清浓度的增高协同作用增加。结果见表2。表1自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清（4d）对肝癌细胞的杀伤效应表2六味地黄丸含药血清（8d）联合10%tk /GCV系统对CBRH7919作用的杀伤效应 [1] [2] [] [] 3讨论 　　自杀基因治疗之所以能成为恶性肿瘤基因治疗的研究热点和最有应用前景的肿瘤基因治疗方法，是由于自杀基因治疗存在旁杀伤效应（或称为旁观者效应）的独特机制。所谓旁杀伤效应是指导入了自杀基因的肿瘤细胞加入前体药物后，不仅自身被杀死，其邻近未导入自杀基因的细胞也被杀死的现象［1-2］。旁杀伤效应形成机制的假说主要包括［14］：（1）“缝隙连接”机制；（2）免疫介导机制；（3）“细胞凋亡”机制；（4）介质机制；（5）抗肿瘤血管生成等。由于在整体水平基因转染效率很低，同时病毒载体的使用也带来了一定的毒副作用，故自杀基因疗法存在旁杀伤效应这一独特的作用机制具有许多优势，如能减少对高转染率的要求，减少载体过量引起的毒副作用等。但在目前的情况下，由于体内转染效率较低等原因，使肿瘤自杀基因治疗的效果仍不十分令人满意。以增强旁杀伤效应为目标的联合治疗是目前肿瘤自杀基因治疗的研究热点之一。现有中药方药药理作用的研究结果提示：中药方药有可能针对自杀基因旁杀伤效应的机制，通过增强自杀基因旁杀伤效应对肿瘤自杀基因疗法产生协同作用。我们前期的动物在体实验研究表明，自杀基因疗法联合滋阴补肾中药名方六味地黄丸能更有效地抑制小鼠移植性肝癌的生长［9］。初步的体外实验结果也表明，自杀基因疗法联合滋阴补肾中药名方六味地黄丸含药血清在自杀基因系统杀伤肝癌细胞时发挥协同作用［10］。本实验结果显示：在大鼠血清总浓度为10%的条件下，六味地黄丸灌胃4d的含药血清在50%、10%含药血清浓度下，与自杀基因系统联合作用的抑制率为2151%、2878%，较单纯自杀基因系统的抑制率1449%分别提高了702%、1429%；六味地黄丸灌胃8d的含药血清，在25%、50%、10%浓度下，与自杀基因系统联合作用的抑制率为2666%、3214%、3089%，较单纯自杀基因系统的抑制率2193%分别提高了47%、102%、90%，呈现剂量依赖关系。结果表明六味地黄丸能增强自杀基因疗法对肝癌细胞的杀伤效应。我们还比较了4d含药血清和8d含药血清的增效作用效果，结果显示无显著性差异，提示灌胃4d含药血清即可满足实验要求。 【参考文献】 ［1］Bi W L,Parysek L M,Warnick R,et al.In vitro evidence that metabolic cooperation is responsible for the bystander effect observed with HSV tk retroviral gene therapy［J］.Human Gene Therapy,1993,4(6):725.［2］Freeman S M,Abboud C N,Whartenby K A,et al.The“bystander effect”：tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified［J］.Cancer Res,1993,53(21):5274.［3］Mohr L.Hepatocellular carcinoma:novel therapeutic approaches［J］.Schweiz Rundsch Mde Prax,2007,96(14):553.［4］Lemken M L,Graepler F,Wolf C,et al.Fusion of HSV1 VP22 to a bifunctional chimeric super CD suicide gene compensates for low suicide gene transduction efficiencies［J］.Int J Oncol,2007,30(5):1153.［5］孙春晓，何荣根.恶性肿瘤自杀基因治疗研究进展［J］.实用肿瘤杂志,1999,14(4):255.［6］杜标炎,徐勤,吴绍锋,等.六味地黄汤对糖皮质激素肾阴虚模型免疫器官淋巴细胞凋亡的抑制作用(Ⅰ)［J］.广州中医药大学学报,2000,17(3):204.［7］刘福君,茹祥斌.地黄及六味地黄汤(丸)的免疫药理及抗肿瘤作用［J］.中草药,1996,27(2):116.［8］宋丽丽,张瑜,张大禄.六味地黄方的免疫、抗肿瘤药理研究［J］.中成药,2001,23(12):910.［9］杜标炎,王慧峰,谭宇蕙,等.六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗的增效作用［J］.广州中医药大学学报,2007,24(2):132.［10］杜标炎,张爱娟,谭宇蕙,等.自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用［J］.广州中医药大学学报,2008,25(4):319.［11］杜标炎,谭宇蕙,吴映雅,等.逆转录病毒载体介导HSV1tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建［J］.广州中医药大学学报,2004,21(5):395.［12］谭宇蕙,吴映雅,杜标炎,等.大鼠肝癌细胞HSVtk/GCV自杀基因系统的构建及其旁观者效应［J］.世界华人消化杂志,2005,13(17):2069.［13］戴体俊.合并用药的定量分析［J］.中国药理学通报,1998,14:479.［14］刘为池,叶刚.自杀基因治疗旁观者效应研究进展［J］.国外医学:泌尿系统分册,2000,20(增刊):121 [] [] [1] [2]