癌痛平对福尔马林致痛模型大鼠脊髓背角cfos表达及P物质含量的影响

作者：陈敏敏，程海波，张颖，李友林，许惠琴 【摘要】 【目的】观察癌痛平对福尔马林致痛模型大鼠脊髓背角cfos基因表达及P物质（SP）含量的影响。【方法】选用SD大鼠50只，随机分成5组：空白对照组，模型组，曲马多组（剂量为006g/kg），癌痛平高、低剂量组（剂量分别为36、18g/kg）；采用福尔马林右侧后爪掌心皮下注射法复制致痛模型，取脊髓L3~L5节段，采用免疫组化法观测各组大鼠脊髓背角浅层fos蛋白表达及SP含量。【结果】模型组大鼠脊髓背角浅层中fos免疫反应阳性神经元数目及SP免疫阳性反应物的D值均显著增加（P＜001）；癌痛平高剂量组可显著降低fos免疫反应阳性神经数目及SP免疫阳性反应物的D值（P＜001）。【结论】癌痛平可能通过减少脊髓背角神经元对传入的伤害性刺激的反应发挥镇痛作用。 【关键词】 癌痛平/药理学；疼痛/中药疗法；脊髓/病理学；疾病模型，动物；大鼠 癌性疼痛是癌症患者最常见、且最难控制的症状，也是影响患者生活质量的重要因素。应用世界卫生组织（WHO）大力推广的“三阶梯药物止痛法”控制癌痛的方案，疗效虽然比较确切，但长期使用镇痛剂毒副作用大，成瘾性、依赖性强，并受患者耐受性的限制［1］。本课题在已完成的癌痛平治疗癌性疼痛的临床与实验研究基础上［2-3］，进一步对其作用机理进行更深入的研究，现报道如下。 1材料与方法 11动物成年清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量250～300g，由河南省实验动物中心提供， 生产许可证：SCXK（豫）20050001。 12 主要药物和试剂癌痛平由蚤休、鼠妇、制南星、制白附子、荜拔等组成，由南京中医药大学中医药研究院提供；盐酸曲马多片由石家庄制药集团有限公司提供（批号：031002)；兔抗大鼠cfos多克隆抗体、P物质（SP）免疫组化染色试剂盒均为武汉博士德生物技术有限公司产品；二氨基联苯胺（DAB）显色剂为福州迈新生物技术开发有限公司产品。 13 动物分组、用药和造模［4-5］SD大鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。空白对照组不做任何处理；模型组给予等容积蒸馏水；曲马多组给予曲马多006g/kg；癌痛平高、低剂量组分别给予癌痛平36、18g/kg。各组动物均以15mL/kg灌胃给药，给药1h后，用微量注射器抽取体积分数为5%福尔马林100μL注入大鼠右侧后爪掌心皮下复制福尔马林致痛模型。 14取材与切片注射福尔马林30min后以100mg/L水合氯醛500mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，快速开胸，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，进行心脏灌注；先以无菌生理盐水250mL快速冲去血液，至流出的液体变清亮为止，随后用含40g/L多聚甲醛的01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH74)先快后慢灌流固定约30min；打开脊柱，取脊髓L3～L5节段置于含40g/L多聚甲醛的PBS中进行保存；再将组织进行封蜡，常规石蜡切片，片厚5μm，选取结构完整者贴于多聚赖氨酸处理过的玻片上。 15免疫组织化学反应采用链霉亲合素—生物素酶复合物（SABC）法先将切片脱蜡至水，再置于体积分数为10%的过氧化氢中，室温孵育7min，蒸馏水漂洗3次，每次3min；然后将切片放入装有沸腾柠檬酸缓冲液(pH 60)的高压锅中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时，90s后将高压锅撤离热源，冷却5min后置自来水下流水降温，15min后打开高压锅盖，继续自然降温至室温，PBS(pH72～74)漂洗3次，每次3min；滴加体积分数5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，室温20min；甩去多余液体，不洗；滴加1∶100稀释的相应一抗，37℃、80min；PBS漂洗3次，每次3min；滴加生物素化二抗，室温孵育20min，PBS漂洗3次，每次3min；滴加试剂过氧化物酶，室温20min，PBS漂洗4次，每次5min；DAB显色，显微镜下控制显色时间，苏木素轻度复染，自来水充分冲洗，室温下避光干燥，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明,中性树胶封片，阴性对照以PBS代替cfos或SP抗体,其他步骤同上。 16图像观察与分析每只大鼠取切片3张，每组共30张切片，应用电子计算机图像分析技术对切片进行图像分析：将切片置于光镜下，经10×40倍显微镜将一幅图像由显微镜输入后显示在计算机监视屏幕上，选定目标区域，利用江苏捷达图像分析软件于10×20倍测定脊髓背角浅层(I、II层,Rexed分层法)fos样免疫反应(foslike immunoreactive,FLI)阳性神经元(FLIN)细胞数或2个视场内SP免疫反应阳性纤维光密度(D)值。所有切片均在同一光强度下测定。 17统计方法采用SPSS 110软件进行统计分析。 [1] [2] [] [] 2结果 21各组大鼠脊髓背角浅层fos蛋白表达的情况图1结果显示：光镜下见脊髓背角浅层内有大量的fos免疫反应阳性神经元，fos阳性神经元呈棕黄色，定位于细胞浆。计算机图像分析检测结果显示：模型组脊髓背角FLIN数目高于空白对照组(P＜001)；与模型组比较，癌痛平高剂量组和曲马多组大鼠脊髓背角的FLIN数目显著降低(P＜001)。免疫组化染色所显示的对照实验均呈阴性反应，结果见表1。 22各组大鼠脊髓背角浅层SP含量情况图2结果显示：光镜下可见SP免疫阳性反应物主要分布于脊髓背角浅层，以外侧带最为浓密，脊髓的其他部位不着色或呈淡黄色。计算机图像分析检测结果显示:模型组脊髓背角SP免疫阳性反应物的D值高于空白对照组(P＜001)；与模型组比较，癌痛平高剂量组的大鼠脊髓背角的SP免疫阳性反应物的D值显著降低(P＜001)，结果见表1。表1各组大鼠脊髓背角浅层FLIN细胞数、 SP阳性纤维光密度值比较 　　3讨论 P物质是伤害性初级传入末梢释放的一种兴奋性神经递质，是导致在伤害性刺激停止作用后持久性疼痛和痛觉过敏的重要物质［6］。它存在于脊髓RexedⅠ层和Ⅱ层的Aδ和C纤维上，持续电、热、化学等多种外周性伤害刺激这些传热纤维可引起脊髓背角SP的释放，使脊髓背角的SP明显增多［7-10］。Fos是cfos的蛋白表达产物，cfos原癌基因是存在于神经细胞内的即刻早期基因(又称为第三信使)，正常情况下，细胞内cfos很少表达，外周性伤害刺激等因素可刺激脊髓内cfos基因表达fos，而且在一定程度上，所受刺激的强度与fos免疫阳性神经元的数量成正比［9-11］。本实验结果表明：当大鼠足趾皮下注射福尔马林以后,其脊髓背角浅层中fos免疫反应阳性神经元数目和SP含量、D值都有明显的增加，与文献所述皮下注射福尔马林立即引起C传入纤维自发活动剧增［2］，引起P物质释放的增加［6］、cfos原癌基因的表达增强［12-13］一致。服用癌痛平后,可以明显降低fos免疫反应阳性神经元数目和SP免疫阳性反应物的D值。提示癌痛平是通过减少脊髓背角神经元对传入的伤害性刺激的反应,阻止脊髓痛觉的传导来起到镇痛作用的，但其是否通过其他通路来缓解疼痛症状还需进一步研究。 【参考文献】 ［1］杨萍.癌痛治疗的近况［J］.中国肿瘤,1998,7(1):22.［2］吴勉华,周学平,程海波，等.癌痛平胶囊治疗癌性疼痛的临床研究［J］.中国中西医结合杂志,2005,25(3):218.［3］吴勉华,许惠琴,周红光，等.癌痛平胶囊镇痛作用的实验研究［J］.江苏中医药,2004,25(11):55.［4］徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社,1982:884.［5］林青,杨锡馨,林财珠.曲马多对福尔马林致痛大鼠行为学及脊髓Fos蛋白表达的影响［J］.中华麻醉学杂志,2004,24(5):398.［6］张天锡,印其章.疼痛机制与疼痛治疗(1)［J］.外科理论与实践,2003,8:附21.［7］Wang X Y,Yang G. Progress of study on the mechanism of substance Ps participating in the algesia control in spinal cord［J］. For Med Sci:Anesthesiol Resusc,2001,22:5.［8］ Brodin E,Linderoth B, Gazelius B, et al.In vivo release of substance P in cat dorsal horn studied with microdialysis［J］. Neurosci Lett,1987,76(3):357.［9］ Bullitt E. Expression of cfoslike protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat［J］. J Comp Neurol, 1990,296(4)∶517.［10］ Hunt S P, Pini A, Evan G. Induction of cfos like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation［J］. Nature,1987,328∶632.［11］ Presley R W, Menetrey D, Levine J D, et al. Systemic morphine suppresses noxious stimulusevoked Fos proteinlike immunoreactivity in the rat spinal cord［J］. J Neurosci,1990, 10 (1)∶323.［12］Kiran Y, Patrick M, John E, et al. Comparsion of the effects of treatment with intrathecal lidocaine given before and after formalin in both noception and fos expression in the spinal cord dorsal horn［J］.Anesthesiology,1998,88:157.［13］Dahmen N, Fischer V, Hodl P, et al. Induction of cfos gene expression by the elective sigma receptor ligand EMD 57445 in rat brain［J］. [] [] [1] [2]